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CCK-8实验小贴士
日期:2016年08月08日 信息来源:深圳市纽邦生物科技点击率:4149

CCK-8实验如何完美操作?下面是38条CCK-8实验小贴士,希望对你有所帮助。

Q1. 设定参比波长的目的是什么?必须设定吗?
A1. 不一定要设定。
CCK-8试剂在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊所带来的吸收。
 
Q2. 如何设定空白对照?
A2. 可在不含细胞的培养基中加CCK-8,测定450 nm的吸光度作为空白对照。在做加药实验 (细胞毒性实验) 时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中测定450 nm的吸光度作为空白对照。
 
Q3. 在做加药实验时,药物对测定是否有影响?如何解决?
A3. 有时会有影响。如果药物具有氧化还原性,会和CCK-8发生反应,吸光度发生变化。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8, 测定450 nm 的吸光度,如果它的吸光度与不含药物的培养基 (加CCK-8) 的吸光度相比有明显变化,则证明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。
 
Q4. 不更换培养基加CCK-8试剂,有没有问题?
A4. 一般没有问题。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话,有可能会产生误差,必须
更换其它培养基。
 
Q5. 哪些物质会影响CCK-8的测定?
A5. 当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定,增加O.D.值;在有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生,减小O.D.值;在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可;血清不影响测定。
 
Q6. 说明书上仅写了96孔板的测定方法,如果使用24孔板或12孔板,应该加多少量CCK-8试剂?
A6. 一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。
 
Q7. 如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差?
A7. 可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。
 
Q8. 每次测定的O.D.值不一样,是什么原因?如何解决?
A8. 可能会有以下几个原因:
1、当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,导致培养基的体积不一样,从而增加误差。 一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。
2、有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差,建议在加入CCK-8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。
3、每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。
 
Q9. 在CCK-8显色过程中,如何终止反应?
A9. 有以下几种方法(96孔板):
1、可以向每孔中加入10 μl Stop Solution(货号:CK13),并遮盖培养板避光保存在0-5℃条件下,在7天内吸光度不会发生变化。
2、每孔加10 μl 0.1M HCl溶液。
3、在显色反应后,将培养板放入4℃冰箱内。
 
Q10. 在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,如何解决?
A10. 可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如:可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。
 
Q11. 必须预培养细胞吗?
A11. 不一定。如果要想保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有研究人员不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
 
Q12. 如果加入的药物中含有金属,是否会有影响?
A12. 金属对CCK-8显色有影响。终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降低。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。
 
Q13. CCK-8的保质期有多久?
A13. CCK-8在避光0-5℃的条件下可以存放1年,在-20℃下避光可以保存2年。如果需要长期保存,我们推荐在-20℃储藏。正常的CCK-8颜色为浅粉红色,如有明显颜色变化,则CCK-8的质量有可能发生变化。CCK-8若反复冻融有可能会增加空白吸收,从而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。
 
Q14. 预培养后,更换培养基需要细胞计数吗?
A14. 一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞,用血球计数盘计数,制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精确计数细胞,可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
 
Q15. CCK-8是否对细胞进行染色?
A15. CCK-8不对细胞进行染色。培养基中的WST®-8并不进入细胞内染色细胞,而是在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为高度水溶性的黄色甲臜染料,是一个显色反应。显色反应后,更换新的培养基,可以继续培养细胞。
 
Q16. CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样?
A16. 不同细胞的脱氢酶活性不一样,显色程度不一样,因此灵敏度也不一样。
 
Q17. 悬浮细胞和贴壁细胞在接种数量上有何区别?
A17. 大部分悬浮细胞相比贴壁细胞比较难显色,O.D.值偏低,一般需要增加细胞接种数量或延长加入CCK-8后的培养时间。贴壁细胞显色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。
 
Q18. 应该每次做标准曲线吗?
A18. 建议每次做。虽然细胞是一样的,但是细胞的状态不一定一样。对于状态不一样的细胞,建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样,灵敏度可能会有轻微的差异,对于不同的批号建议分别做标准曲线。
 
Q19. 有时在药物作用情况下,细胞已经死亡,但是脱氢酶的活性还在,是否能计算细胞数量?
A19. 不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量,如果细胞已经死亡,但脱氢酶的活性还在,则实际测定的活细胞数量将会比真实值高,不能真实反映活细胞数量,建议采用别的方法测定。
 
Q20. CCK-8是什么颜色?
A20. 应该是粉红色。若颜色不一样,有可能会影响测定。
 
Q21. 导入基因后,是否可以用CCK-8来检测活细胞?
A21. 可以。
 
Q22. 在pH 5的培养基中培养细胞,是否可以用CCK-8试剂检测?
A22. 从理论上来说是可以的,但是需要做标准曲线进一步确定。
 
Q23. O.D.值在什么范围比较合适?
A23. 一般情况下O.D.值在0.1-2.0范围内都可以,在1.0附近较好。
 
Q24. 细菌是否会和CCK-8试剂发生反应?(如果想要检测细菌)
A24. CCK-8试剂几乎不会和细菌发生显色反应。细菌防御系统非常强,不会发生还原反应。
 
Q25. WST®-8和CCK-8是否是同一种产品?
A25. 不是,CCK-8是日本同仁化学研究所开发的产品—Cell Counting Kit-8试剂盒的简称,而WST®-8是该试剂盒中的主要成分,并且WST®是日本同仁化学研究所的注册商标。
 
Q26. CCK-8试剂用于测定活细胞的数量,对于增殖期的细胞和静止期的细胞,有何影响?
A26. 一般情况下CCK-8试剂用于检测对数生长期的细胞。如果静止期细胞的脱氢酶活性和增殖期的细胞的脱氢酶活性有很大不同的话,则两者将会有很大的差别。
 
Q27. 如果O.D.值太低,可以采取什么办法?
A27. 可以采取2个办法:
1、适当增加细胞数量
2、延长加入CCK-8试剂后的反应时间。
 
Q28. 在做药物毒性实验时,加入CCK-8试剂培养一段时间后,检测时颜色没有变化,样品O.D.值和空白O.D.值一样,是何原因?
A28. 可能因素有2个:
1、药物的浓度太高,细胞全部被杀死。
2、如果药物有氧化性,则会抑制CCK-8试剂的显色反应,可以采取先更换培养基清洗掉药物,然后再加CCK-8试剂进行检测的方法。
 
Q29. 如何避免细胞聚团现象?
A29. 1、可以消化时间长一些。
2、细胞培养好后,用手摇匀一下。(如果有设备的话最好用设备摇匀)
3、可以用枪头反复吹打,但要避免产生气泡。
 
Q30. 做悬浮细胞的实验时,检测几天比较合适?
A30. 由于不更换培养基,长时间的培养,培养基中的氧气和营养会流失,有可能会影响细胞的状态。一般情况下建议培养4-5天左右,但要确定细胞数量是否已经达到饱和?
*如果需要长时间培养,因为容易蒸发,建议培养板的边缘孔不加细胞。
 
Q31. 如何制作标准曲线?
A31. 先取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中,然后用培养基依次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液,细胞培养一段时间后加CCK-8试剂,继续培养一段时间,等颜色发生明显变化后,用酶标仪进行测定,以细胞数量为X轴,O.D.值为Y轴,就可以作成一条标准曲线。
 
Q32. 细胞数量太多会有什么结果?
A32. 贴壁细胞如果接种太多,细胞在培养过程中容易长满而产生互相挤压的现象,导致细胞状态不好或者死亡。另外,细胞接种太多容易产生O.D.值过高 (甚至于超过仪器的检测范围) 的情况。
 
Q33. BrdU法和CCK-8法有何区别?
A33. CCK-8法是通过检测对数生长期的细胞内的脱氢酶来反映细胞的活性,而BrdU法是检测细胞的DNA合成。CCK-8法只需要加入试剂,通过比色法就可以检测,而BrdU法不仅要加入试剂,而且要固定细胞,通过抗原抗体反应之后用发光法来检测。两者的原理是完全不同的。如果只是检测细胞增殖的话,那么CCK-8的方法是比较简便的。
 
Q34. 在做药物毒性实验时,药物对细胞有抑制作用,但检测结果却是O.D.值升高,为什么?
A34. 很可能药物和CCK-8试剂发生了反应,可以做一个只加药物的空白对照,如果O.D.值确实比正常的空白对照O.D.值高很多,则说明药物和CCK-8试剂发生了反应。可以通过更换培养基清洗掉药物的办法解决。
 
Q35. 加入CCK-8试剂后,为什么在不同时间检测的的值不一样(例如在3小时和在3.5小时)?
A35. 由于CCK-8试剂和细胞内的脱氢酶反应是一个循环反应,随着时间的增加,O.D.值也会不断增加,颜色会不断加深,但细胞数量却没有什么太大变化。一般情况下建议在确定最佳的实验条件 (合适的时间、合适的O.D.值) 后,把加入CCK-8试剂后的培养时间固定下来,以后在同样的培养时间点进行检测。
 
Q36. 组内数据差异比较大或组间数据杂乱,没有规律,是何原因?
A36. 原因有可能是CCK-8试剂在移液枪的枪头上或培养板的孔壁上有残留,加入时最好快速加入以避免残留,还可以采用培养基稀释CCK-8试剂的办法来降低误差:用培养基稀释CCK-8试剂1倍,混匀后每孔加20 μl使用。
 
Q37. 用CCK-8试剂做细胞毒性检测时:
1、贴壁细胞预培养多长时间合适?
2、预培养过程中细胞分裂,如何计算细胞数量?
3、如果预培养时间太长,会有什么结果?
A37. 1、一般情况下建议贴壁细胞预培养的时间为24h。
2、如果只计算药物的LD50值的话,可不必考虑预培养过程中的细胞分裂问题,但要做一个加细胞的对照 (该值为最大O.D.值)。
3、如果预培养时间太长,有可能细胞会增长过多,达到饱和状态,O.D.值将会很高,甚至于超过仪器的检测范围。
 
Q38. 在实验中加入刺激细胞增长的因子,但是细胞数量却没有增加 (或者吸光值没有上升),为什么?
A38. 首先用显微镜观察一下,确定细胞数量是否增加?然后才考虑其他的因素(如果加入的刺激因子和WST®-8发生反应的话,吸光值不变这种可能性是非常低的)。如果显微镜下观察细胞数量确实增加了,则请检查加入的药物是否具有氧化性?有可能抑制了CCK-8试剂的反应。方法是:在有细胞的培养基中做1个加药物和不加药物的对比,然后分别加入CCK-8试剂进行检测,如果不加药物的O.D.值比加药物的O.D.值高,则说明药物确实具有氧化性,产生了干扰。


(转自DOJINDO,如有侵权请及时联系纽邦生物)



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