异嗜性抗体对免疫测定的干扰机制

在免疫测定中，影响结果的干扰因素较多，这些干扰因素是一些与被测物质化学结构不同但活性相似的物质，如异嗜性抗体（heterophile antibody,HA）、人抗动物抗体（human anti-animal antibody,HAAA）、自身抗体、类风湿因子（RF）和其他蛋白等。其中，HA的存在是影响免疫测定的重要因素之一。他通过非特异性结合，桥联捕获抗体、标记抗体或标记抗原从而干扰测定，使测定结果与临床表现不符，导致误诊。

 

HA的特性如与干扰机制

1.概念

HA是由已知的或未知的抗原物质刺激人体产生的一类具有足够滴度、能与多个物种的免疫球蛋白发生相对弱的结合的多重特异性免疫的免疫球蛋白。

2.来源

HA的产生通常是由于人类直接接触到动物、污染的食品、未经高温消毒的鲜奶和免疫疗法或者接种来源于动物血清或组织的疫苗产品后产生。在大多数情况下，直接接触宠物小鼠或实验室小鼠是导致人体产生HA最常见的原因。研究发现，存在人体中的HA包括天然抗体和自身抗体。大多数的HA属于天然抗体，为干扰的主要类型。HA最初在传染性单核细胞增多症的患者血清中发现。据研究证实，在健康人群中，约3%～15%体内含HA。此外，在一些获得性或先天性IgA 缺陷综合征的患者血清中也发现HA的存在。

3、特性

HA属人体内源性抗体，具有相对稳定的化学结构，分子量约160 kD，由于其分子量较大，不易通过肾小球滤过膜，因此HA在正常情况下通常存在于血液中而不会存在尿液中。HA一般无明确的免疫原，可与多种动物抗体结合，具有多重特异性的特点，但其亲和力较弱。研究表明，HA是IgG 亚类中较弱的抗体，可与许多动物免疫球蛋白的Fc 和Fab 表位结合，

而不与抗原结合位点结合。根据HA结合动物免疫球蛋白的部位，可以将其分为两类，一类是可以结合山羊、老鼠、大鼠、马及牛IgG 的Fab 部位，另一类是可以识别老鼠、马、牛和兔子的免疫球蛋白的Fc 段。不同物种的Fab 片段相似，所以HA在牛、羊、马、豚鼠、鼠和猴免疫球蛋白间存在的交叉反应，鼠抗体表现得特别强烈，而兔抗体与其它物种发生的交叉反应少见。有研究发现，HA在糖尿病家族具有保护个体的作用，血清HA阳性者患1 型糖尿病的机率低于HA阴性者。

4、干扰机制

HA 的产生机制至今还不能阐明，目前所使用的免 疫试剂抗体大多源于实验动物，因此，体内含HA 的患者   在做血清免疫检测时，HA 可与试剂抗体结合而导致干扰。HA 通常与试剂抗体的Fc 区表位或者F(ab’)2 区域的决定簇结合。目前公认的HA 在免疫测定中的干扰机制主要发生在夹心免疫测定法和竞争免疫测定法中。    

HA在夹心免疫测定法中的干扰机制

ELISA夹心法测定中，HA与试剂抗体（捕获抗体和标记抗体）的结合，可通过Fc-Fc 和Fab-Fab（见图1）两种结合方式干扰测定。正常情况下，在ELISA 夹心法中，待测抗原同时与捕获抗体和标记抗体结合，形成了固相捕获抗体-待测抗原-标记抗体的复合物（如图1A所示）。在以Fc-Fc 的方式结合的机制中，HA的Fc 端结合到捕获抗体的Fc 段上，而HA的Fab 区域则结合到标记抗体的Fab 区域上，导致假阳性结果（如图1B所示）。在以Fab-Fab 结合方式的机制可引起假阳性或假阴性的结果，如HA的Fab区域通过分别结合捕获抗体的Fab区域和标记抗体的Fab 区域，阻挡捕获抗体和标记抗体与待测抗原的结合，从而导致假阴性（如图1C所示）；HA的F(ab’)2 通过同时结合捕获抗体的Fab区域和标记抗体的Fab区域，形成固相捕获抗体-HA-标记抗体复合物，如果标本中无待测抗原，HA就引起假阳性的结果（如图1D所示）。

                                               

 

 

HA在竞争免疫测定法中的干扰机制

在免疫竞争法测定中，HA干扰也可造成假阳性或假阴性(如图2所示)。在正常的竞争性免疫反应中，待测抗原与标记抗原竞争的结合到连接在载体上的捕获抗体，形成正常的反应复合物（如图2B所示）。但是如果反应体系中存在HA，测定结果将可能出现假阳性或假阴性的现象。造成假阴性结果的机制：HA通过同时结合捕获抗体和标记抗原，形成异常的反应复合物(如图2C所示)，干扰捕获抗体结合检测抗原，消耗可结合待测抗原的捕获抗体，从而导致假阴性。造成假阳性结果的机制：HA直接结合捕获抗体与抗原结合的部位，形成异常的复合物(如图2D所示)，占据捕获抗体结合待测抗原或标记抗原的结合空间，消耗可结合待测抗原或标记抗原的捕获抗体，导致假阳性。

       

 

 

                                          

 

3-位点免疫检测法中的干扰机制

该干扰存在于肌钙蛋白I的免疫检测中。所谓的3-位点是试剂盒中含有针对肌钙蛋白I分子上3个不同抗原决定簇的3种抗体，肌钙蛋白I可以同时结合2个捕获抗体与1个示踪抗体或者1个捕获抗体与2个示踪抗体，使特异性和灵敏度大大提高，后者可使反应的灵敏度进一步增高。由于肌钙蛋白I 3-位点免疫测定增加了一种捕获抗体或者标记抗体，这也同时提高了捕获抗体或者标记抗体与HA结合的机率，从而导致肌钙蛋白I 3-位点免疫测定比肌钙蛋白I 双位点免疫测定更加容易受到HA的干扰，结合的部位与上述两种机制相似。

 

5、受HA干扰的常见检测项目

HA在免疫实验测定中对项目的干扰较广，但机率较低，现举例分述如下。

对内分泌的检测 

在对内分泌的检测项目中，如在皮质醇的检测（罗氏模块E170 竞争免疫分析）中，HA的干扰是由于它的F（ab’）2 片段与捕获抗体的F（ab’）2 片段有相应的结合位点而结合，并且抑制待测皮质醇或者标记皮质醇与捕获抗体的结合，从而导致该免疫测定出现假阳性。或者HA通过桥联捕获抗体和标记皮质醇，导致该免疫测定出现假阴性[10]。又如我们在使用免疫放射法(IRMA)和化学发光法(CLIA)对胰岛素样生长因子-1(IGF-1)检测时发现，HA的干扰可造成IGF-1 的测定呈假阴性的结果。实验证明，用HA阻断试管处理后，IGF-1 的测定结果与临床表现相符。还有对于患有结节性甲状腺疾病的患者，在做降钙素(CT)测定时，由于受到HA的干扰，致使造成假阳性的结果，最终导致患者被误诊为甲状腺髓样癌等。

对肿瘤标志物测定

对于CEA 的免疫分析，Oslo 中心实验室Bjirner等曾报道，HA对CEA测定的干扰引起假阳性和假阴性结果的机率是4％。用Medics 检测PSA 时，HA通过结合鼠源性单克隆抗体（PSA 捕获抗体试剂）与标记的小鼠单克隆抗-PSA 检测抗体，从而导致PSA假阳性结果。

对心脏标志物的免疫测定

在肌钙蛋白T第三代CARDIAC T 检测法中发现存在HA干扰。实验证明，用患者的血清与正常小鼠血清孵育（室温1 h），然后用CARDIC T 法测量的心肌肌钙蛋白T，可明显消除HA的干扰。HA的干扰主要是通过在捕获抗体和标记抗体之间形成桥梁以干扰夹心法的测定，从而导致肌钙蛋白T假阳性。

对病毒相关抗原抗体检测

近年来研究人员发现[17]，在使用胶体金法快速检测HIV 时，HA的干扰可造成HIV 的测定呈假阳性的结果，实验证明，用HA阻断试管处理样本后，重新对样本进行测定，结果为阴性。另外，对于这些疑为有HA干扰的样本，我们可以利用过去使用的快速凝集试验检测样本中是否有HA的存在。一般情况下，在对患有传染性单核细胞增多症的患者血清检测HA

时，结果显示出有很高的特异性。但偶尔会在以下情况检测HA时出现假阳性结果，如白血病、麻疹、疟疾、系统性红斑狼疮、胰腺癌、病毒性肝炎以及人类免疫缺陷病毒感染。例如，急性戊型肝炎患者用快速凝集法检测HA会出现假阳性结果。

对细胞因子（如IL-2、TNF、IFN）检测的干扰

用ELISA 夹心法对干扰素-α进行检测（所用的试剂为羊抗人干扰素-α多克隆抗体和生物素标记的鼠抗人干扰素-α单克隆抗体），HA通过桥联鼠抗人干扰素-α单克隆抗体和羊抗人干扰素-α多克隆抗体从而出现假阳性的结果，在反应体系中添加5％的小鼠血清可有效地吸附HA。

治疗药物监测

针对一些有免疫测定干扰史的患者，在其进行肝移植手术后，对其血药浓度他克莫司的测定发现存在假阳性的现象，可能为HA干扰的结果。

 

6、HA干扰的消除措施

由于标本中HA的来源是未知的，不能够准确的针对HA的结合位点进行操作，目前尚未有一个完全消除HA干扰的方法。以下就现有的消除HA的方法进行分述。

稀释法

如果样本HA浓度含量不是很高，且它所造成的干扰不是很大时，稀释法是可以减少它的干扰，但不能完全消除。据报道，稀释法对使用AxSYM 测定HCG中受到HA的干扰具有很好的消除作用，因为在它的稀释液中已经含有一定量低浓度的动物蛋白来吸附HA。在对其样本稀释后，降低了HA的浓度，在低浓度动物蛋白来吸附HA后，原有的干扰强度可明显减小。

使用异嗜性抗体阻滞剂、阻断试剂盒或阻断试管

目前市场上已经有商品化的阻断剂如：IIR、NS-ABT、HBR、Heteroblock、MAB33 及poly

MAB33。将它们加入待测的样品中，利用非特异性和特异性阻断剂与HA结合从而达到减少干扰的目的。消除干扰的效果通常由干扰物的浓度、类别或亚类，以及阻断剂的类别和分型所决定。如，奥林巴斯公司在对铁蛋白检测时，用F(ab’)2 相关试剂提前处理待测样本可在一定程度上消除HA的干扰。异嗜性阻断试剂盒现在已广泛使用。其内部特制的免疫球蛋白，可用于中和免疫测定法中产生干扰的HA。HA阻断试剂对预防假阳性的HCG结果有很好的效果，但添加鼠免疫球蛋白对预防假阳性的HCG结果无影响。又如使用HA阻断试管。使用贝克曼化学发光免疫法测定检测如游离PSA特异性抗原等项目时，样本在检

测前用HBT处理，大大减少了假阳性的发生率。

提取法

可以采用吸附在氟乙烯表面的鼠McAb，固相结合在琼脂糖凝胶柱上的蛋白G或者蛋白A去提取HA的方法、三氟乙酸沉淀法、巯基试剂法、阳离子交换剂和亲和层析等方法，均对消除HA有一定效果。但不宜使用热或酸处理来灭活血清中的HA，因为大多数的分析物都不稳定。

利用活体生物素单链抗体作为捕获试剂

使用活体生物素单链抗体作为捕获抗体用于固相抗原的测定技术可以在一定程度上有效地避开HA的干扰。将活体生物素单链抗体作为捕获抗体结合到固相的抗原上，再加入已经用标记的亲和素结合到生物素上，形成固相抗原-活体生物素单链抗体-标记亲和素复合物，由于生物素与亲和素的结合为高度特异的结合，故可较有效地避开HA的干扰。此外，在活体生物素单链抗体与固相抗原发生特异性的反应结合过程中，即使样本里存在有HA，它以Fab-Fab的结合模式结合到过剩的生物素单链抗体试剂上，最终也只能被冲洗清除，从而使测定在一定程度上避开HA的干扰。