五聚体(ProImmune)结合胞内细胞因子染色在国外正在成为很多实验室的常规实验。五聚体可用于检测和分离少至淋巴细胞0.02%的抗原特异性CD8+T细胞群。然而，并不是所有的抗原特异性T细胞都具有功能，功能性细胞的比例因个体和疾病不同而异。可以通过对另外的胞内细胞因子联合染色来研究抗原特异性T细胞的免疫效应功能。
细胞因子的产生对免疫反应起着重要的作用。细胞因子作用的范例包括干扰素-γ（IFNγ）诱导产生的许多抗病毒蛋白、IL-2诱导产生的T细胞增殖、以及肿瘤坏死因子α（TNFα）对病毒基因表达和复制的抑制。细胞因子不是预先形成的，而是在受到相关刺激时才迅速产生和分泌的。因此，胞内细胞因子的染色依赖于在蛋白转运抑制剂存在的情况下（以将细胞因子截留在细胞内）对细胞的刺激。
激起细胞因子产生的细胞活化一般会导致T细胞受体的下调。因此，如果需要同时检测T细胞特异性，则应在细胞活化前进行Pro5R五聚体染色以确保染色水平。在此期间五聚体可能会与T细胞受体一同被内化，但仍可以在透化细胞内检测到。研究抗原特异性T细胞的效应功能时，先将细胞以五聚体染色，然后再用抗原刺激，随后用针对细胞外表位（如CD8）的特异性抗体进行染色，最后再进行膜透化和胞内细胞因子染色。
Pro5R五聚体的胞内细胞因子染色使研究者能够测定对一个抗原刺激产生功能性应答的抗原特异性CD8+T细胞的比例。这在对特定免疫应答的监测和对不同疾病的反应之基本差异的了解方面都有影响意义。
下面的实验操作是应用Pro5R五聚体结合胞内因子染色检测IFNγ、TNFα、MIP-1β或IL-2。某些细胞因子如IL-4和IL-10用胞内细胞因子染色法较难检测，此外，这类细胞因子阳性的五聚体细胞比率可能很低。
材料和仪器
n 细胞样本（如PBMCs）
n Pro5RMHC Class Ⅰ五聚体连接荧光标记（如R-PE）
n 荧光标记的细胞因子抗体，如anti-human IFNγ FITC; ProImmune(不同荧光标记的五聚体)
n 荧光标记的CD8抗体
n 肽（储存在50mg/mL的DMSO中—可分装保存于-20℃）
n Leukocyte activation cocktail (LAC; 可选) 作为细胞因子产物对照（BD Biosciences#55083—可分装保存在-80℃）
n 细胞因子IC对照细胞（可选）用于在胞内细胞因子染色时的阳性对照（eBioscience#00-4509）
n PBS缓存液（含2%FCS，0.1%叠氮钠）
n Permeabilization缓存液（含0.1%saponin，1%FCS，0.1%叠氮钠的PBS）
n 4% Paraformaldehyde多聚甲醛
n Fix buffer（含1%热灭活小牛血清HI-FCS，2.5%甲醛的PBS）
n R10培养液（RPMI1640，含10%HI-FCS，10mMHEPES，2mM L-谷氨酰胺，50mM 2-ME，100U/mL青霉素，0.1mg/mL链霉素）
n Brefeldin A（Sigma #15870）
n 12×75mm 圆底管
n 台式冷冻离心机，水平转子和配套管架
n 冷冻微型离心机
n 涡旋混合器
Pro5R五聚体结合胞内细胞因子染色检测IFNγ、TNFα、MIP-1β或IL-2
操作步骤
步骤10前的所有操作在无菌环境下进行，使用无菌缓存液和无菌条件。
1. 离心Pro5R五聚体，冷冻微型离心机（14000×g，5min）。
2. 制备外周血细胞，PBS中细胞浓度2×107cells/ml。
3. 分别将细胞悬液50μl加入到多个试管中。
4. 添加荧光标记的五聚体到需要的试管中，22℃孵育10min（无刺激的信号对照在该步骤时不要染色）。在剩下的试管中加入10μl的PBS。
5. 在每个管中加入500μlPBS，离心450×g，5min，10℃。
6. 去掉上清液，震动分散细胞，用200μl的R10培养液重悬。
7. 用R10培养液1:50稀释肽蛋白原液。取2μl（终浓度10μg/ml）加入到需要的管中。
如果使用LAC作为对照，在37℃水浴中快速复溶，取0.33μl至每个需要的管。使用后，丢弃剩下的LAC。
8. 将试管置于37℃，加湿CO2培养箱中孵育15min-1h。
9. 加入Brefeldin A（终浓度10μg/ml）到需要的管中（注意：LAC中含有Brefeldin A），重新放回培养箱中孵育15h。
孵育中产生特定细胞因子的最佳刺激阶段是不同的，是需要确定的。上述实验中16h的孵育时间是对人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激诱导产生IFNγ的最佳孵育时间。根据刺激方法和选择的细胞因子效应，孵育时间各不相同。
10. 从培养箱中取出试管，离心450×g，5min，10℃。
11. 去除上清，在需要的管中用50μl含最佳浓度的anti-CD8抗体的PBS重悬细胞，其它管中加50μlPBS。
信号-颜色对照在此步骤时染色。另外，如果需要样本额外的亚型，针对其它细胞表面标志或受体的抗体也在这时加入。
12. 冰上孵育20min。
13. 每管加入500μlPBS洗涤，离心450×g，5min，10℃。
15. 每个样本管加入200μl 4% Paraformaldehyde，涡旋混匀。冰上孵育20min。
此步中要固定活细胞形态。
此步时操作可以暂停，重复进行13和14步，重悬细胞，100μlPBS/管，遮盖管口，细胞放4℃可储存3天。再次进行操作时，重复步骤13和14，重悬细胞每管200μl Permeabilization，然后进行步骤17。
16. 每管加入200μl Permeabilization。
17. 离心450×g，5min，10℃，弃上清。
18. 样品管加入100μl Permeabilization，用抗细胞因子抗体染色。在剩余管（如信号-颜色对照）中加入100μl的PBS。
19. 室温孵育5min。
20. 加入最佳浓度的FITC-抗细胞因子抗体到需要的样品管中，混匀。
21. 室温孵育20min。
22. 每管加入200μl Permeabilization，离心450×g，5min，10℃，弃上清，震动分散细胞。
23. 200μl Fix buffer重悬细胞，涡旋混匀。
加入固定液时涡旋是很重要的，以使细胞不会成团。
24. 此时样本可用于在流式细胞仪上数据采集和分析，也可存于4℃过夜后再分析。
注意：
1. 孵育阶段：特定的细胞因子诱导刺激的最佳时间是不同的需要确定的。上述实验中16h的孵育时间是对人PBMCs用10μg/ml肽蛋白刺激诱导产生IFNγ的最佳孵育时间。根据刺激方法和选择的细胞因子效应，孵育时间各不相同。
2. 肽蛋白浓度：调查细胞因子反应效应的滴度。
3. 五聚体染色：细胞活化产生细胞因子可能会使T细胞受体下调，这会影响随后的五聚体染色，所以，推荐五聚体在细胞活化之前染色。
4. 抗体浓度：调查anti-CD8和anti-cytokine抗体的有效滴度。anti-CD8抗体滴度会阻止其它抗体介导的封闭或与五聚体竞争结合的位点。
5. 蛋白质转运抑制：Brefeldin A抑制细胞内蛋白的转运。细胞培养环境中Brefeldin A菌的存在会阻止蛋白质在高尔基复合体的转运，使蛋白质积聚在内质网内。Brefeldin A菌会增强大多数胞内细胞因子的检测，所以，建议在特定的实验中需要检查实验试剂的有效性，是否含有蛋白质转运制抑制剂（如Monensin）。
6. 背景染色：当进行五聚体染色时，如果背景染色过高，需先用Fc封闭或10%小鼠血清来封闭细胞。其它减少非特异染色的方法可参见ProImmune相关技术文献。
7. 如果需要没有五聚体结合的胞内细胞因子染色则去掉实验步骤1-4。
中文翻译实验操作仅供参考，详细方法请联系我们索取英文版。
