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Evrogen最新款Trimmer-2 cDNA均一化试剂盒
日期:2014年12月31日 信息来源:深圳市纽邦生物科技点击率:3123

原理:

在真核细胞中,各种mRNA以不同丰度构成了总RNA1%。一般来说,5-10个高丰度表达基因转录在单个细胞中可达到几千个拷贝,占mRNA20%500-2000个中等丰度表达基因转录在单个细胞中有几百个拷贝,占mRNA40-60%;而剩下20-40%mRNA则是由一到几十个拷贝的低丰度转录本组成。这种基因转录水平上的巨大差异使大规模的转录分析复杂化,导致多丰度cDNA的重复测序,给文库的筛选和分析带来障碍。

cDNA的均一化降低了高拷贝基因的丰度,使在cDNA样本中的基因浓度趋于一致,因此可以大大提高测序的效率和发现极低丰度基因的能力。

利用Duplex-Specific NucleaseDSN)进行cDNA均一化是一种可应用于全长丰富的cDNA均一化的高效方法。此方法基于核酸杂交动力学和双链DNA特异的DSN酶的独特特性。

DSN是来自红金蟹的一种特异性核酸酶,具有热稳定性,在60-65℃时具有最大活力,即使在70℃高温孵育20min后仍然具有25%的活力,正是由于DSN的热稳定性,在cDNA复性条件下dsDNA降解,可以防止二级结构和ss cDNA片段里的adapter sequences非特异性杂交的形成。

复性过程中,高丰度基因更频繁地转变为双链的cDNA。这样,就明确地形成了两部分:高风度的cDNA部分和均一化的单链cDNA,接着双链cDNADSN降解;ss cDNA可经PCR放大,对PCR引物和条件进行了优化,减少对更短片段的扩增趋势。

可进行均一化的cDNA的制备应该基于总RNA或者polyA+RNA,并且在两端应该含有已知的adapter sequences以用于PCR扩增。对于构建全长cDNA文库来说,RNA的质量是至关重要的。在cDNA合成过程中,可用多种方法在cDNA末端引入侧翼序列,如:adapter连接和模板交换法。

利用DSN均一化已成功用于多种动物和植物模型,这种灵活的均一化方法稍加修改即可应用于多种用途。

应用:
DNA normalization
技术是一种新型的高效平衡化未克隆的全长富集cDNA的有效方法。Trimmer-2试剂盒是Evrogen公司独有产品,利用DNA normalization技术,高效降低高丰度表达基因、富集低丰度表达基因,得到的cDNA包含相等浓度的不同基因,可应用于cDNA文库的构建和直接测序,以及在后续的测序平台Illumina/Solexa ABI / SOLiDRoche / 454上的高通量测序。另外,这个试剂盒还与构建cDNAClontechSMART-based kit兼容,来用于cDNA均一化。

特点:

l  快速有效地降低在文库中高拷贝存在的cDNA 的丰度

l  克隆文库前对全长丰富的cDNA进行均一化

l  操作简单,无需物理分离步骤

l  Illumina /Solexa,ABI / SOLiDRoche / 454的测序实验完全相容

品牌

货号

品名

规格

Evrogen

NK003

Trimmer-2 cDNA normalization kit

For 10 reactions

 

典型结果图:

 

(A) Agarose/EtBr gel-electrophoresis of non-normalized (1) and normalized (2) human cDNA samples;

(B) concentration of abundant transcripts in these samples revealed by Virtual Northern blot. GPDH – glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; UBC – ubiquitin C; M, 1-kb DNA size markers (SibEnzyme).

(C) Normalization significantly increases gene discovery rate of cDNA library. Transcript distribution in standard and normalized cDNA libraries from Aplysia neurons: yellow – all sequences, blue – unique sequences; green – non-unique sequences

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